La chiesa di Sant'Antonio da Padova fu edificata a spese dell'Università nel 1652, nel luogo chiamato “Orticello”, ubicato fuori dalle mura del castello e corrispondente al sito in cui ancora oggi essa sorge. La chiesa no era grande e misurava in lunghezza 30 palmi (metri 7,12), in larghezza 18 palmi (metri 4,75) e in altezza 20 palmi (metri 5,28). La costruzione della chiesa in quel periodo del Seicento, in cui la popolazione versava in condizioni di vita precarie e difficili, si riconduceva al bisogno di normalità; gli anni 1650-1652 furono particolarmente infelici per S. Ambrogio, stretto nelle difficoltà apportate dalla carestia e dalle frequenti epidemie. Nell'anno 1647 gli abitanti ambrosiani avevano palesemente mostrato la loro disapprovazione nei confronti degli esattori delle tasse di Montecassino e forse la costruzione della chiesa servì anche a sanare le controversie e ad invocare in qualche modo il perdono dell'abate. Nel 1742 era eremita di questa chiesa frà Alicandro di Mantova.